INFLUÊNCIA DO ESTÍMULO DA MEDULA ÓSSEA NA RESPOSTA OSTEOGÊNICA SISTÊMICA: ESTUDO EXPERIMENTAL EM COELHOS
THE INFLUENCE OF THE STIMULATION OF BONE MARROW IN OSTEOGENIC SISTEMIC RESPONSE: EXPERIMENTAL RESEARCH IN RABBITS
Dr.Fabiano Rebouças - Tese de Mestrado
RESUMO
Objetivo: Avaliar a influência da resposta osteogênica sistêmica, causada pelo estímulo da medula óssea à distância, na consolidação de falha óssea. Método: Foram utilizados 36 coelhos adultos jovens, machos, pesando entre 2,5 e 3,3kg. Os animais foram submetidos a ostectomia do rádio direito, com retirada de 4mm de fragmento ósseo e divididos aleatoriamente em três grupos (A, B, C). Os animais do grupo A foram submetidos ao estímulo da medula óssea pela abrasão/aspiração da medula óssea do fêmur esquerdo. Os animais do grupo B foram submetidos ao estímulo da medula óssea pela introdução de fio de Kirschner com 1,5mm de espessura, no interior do canal medular femoral esquerdo. Os animais do grupo C não foram submetidos ao estímulo da medula óssea à distância, sendo utilizados como grupo controle. Foram realizadas radiografias semanais até a 4a semana pós-operatória, quando os animais foram sacrificados. Foi realizado estudo histomorfométrico do calo ósseo formado no local da ostectomia. As radiografias foram avaliadas segundo o sistema do escore radiográfico de Lane e Sandhu para análise da evolução da consolidação no local da ostectomia. Resultados: No final do experimento, os grupos que sofreram estímulo medular à distância tiveram menor número de células ósseas, comparativamente ao grupo controle. No estudo radiográfico não houve diferença na evolução da consolidação entre os grupos. Conclusão: O estímulo da medula óssea à distância influenciou desfavoravelmente a consolidação de falha óssea em coelhos.
Descritores: Coelhos/cirurgia. Medula óssea. Consolidação da fratura. Calo ósseo.
SUMMARY
Objective: Assess the influence of sistemic osteogenic response caused by distant stimulation of bone marrow in the consolidation of a bone gap. Method: It were used 36 young adult rabbits, male, weighting from 2,5 until 3,3kg. The animals were submitted to ostectomy of right radius and it were removed 4mm of bone that were randomly shared in 3 groups (A, B, C). Group A animals had their bone marrow stimulated for abrasive aspiration of bone marrow from left femur. Group B animals had their bone marrow stimulated for introduction of a Kirschner wire of 1,5mm thickness inside the shaft of the left femur. Group C animals haven`t had distant stimulation of their bone marrow and they were used as control group. It were used x-ray performed every week until 4a week after surgery, when the animals were sacrificed. It was performed histomorfometric study of the bone callus created in the place of the ostectomy. The x-ray were valuated according to radiographic score of Lane and Sandhu to analyse the evolution of bone consolidation in the place of the ostecomy. Results: In the end of the research, the groups that had distant bone marrow stimulation had lesser number of bone cels comparing to control group. In the radiographic study there weren`t any difference in the evolution of consolidation between the groups. Conclusion: Distant stimulation of the bone marrow had an unfavorable influence in the consolidation of a bone gap in rabbits.
Key words: Rabbits/surgery. Bone marrow. Fracture healing. Bony callus.
INTRODUÇÃO
O processo de reparação da fratura envolve fatores locais e sistêmicos. O primeiro fator local presente no momento da fratura é o sangramento das extremidades ósseas fraturadas. O sangue que acumula e preenche todo o espaço ao redor das superfícies fraturadas forma um coágulo. Com a ativação da cascata de coagulação tem início a resposta inflamatória sistêmica aguda, com invasão de células inflamatórias em todas partes moles vizinhas. Inicia-se, então, a formação do tecido de granulação no coágulo, que logo é preenchido por células mesenquimais. Assim que tem início a formação de cartilagem no local do hematoma, ocorre a proliferação das células periosteais na região das extremidades fraturadas. As células mesenquimais da região central, então, começam a se diferenciar em matriz cartilaginosa extracelular, formando o calo cartilaginoso, que é gradativamente trocado por tecido ósseo por via endocondral.(1-3)
A resposta osteogênica sistêmica foi observada após estímulos distantes do foco de fratura, como na lesão da medula óssea(4-8) e/ou na perda sanguínea(9,10).
O estímulo da medula óssea, local ou à distância do foco da fratura, pode estar diretamente relacionado com o estímulo da formação óssea e da consolidação das fraturas pela resposta sistêmica. Tavares et al(4) descreveram consolidação mais rápida em coelhos submetidos à ostectomia do rádio associado ao estímulo da medula óssea à distância, com a colocação de fio de Kirschner intramedular femoral. Uma das hipóteses que podem justificar este fenômeno é a ação dos fatores de crescimento, que são produzidos no local da regeneração medular e liberados na circulação.(5,6) Existem outros fatores que são liberados na circulação por intermédio da regeneração da medula óssea, como o 14 amino acid peptide – osteogenic growth peptide (OGP). O OGP sintético com estrutura idêntica a original estimulou a proliferação e ativação da fosfatase alcalina de células osteoblásticas in vitro e aumentou a massa óssea em ratos.(11-13)
A perda sanguínea também está diretamente relacionada com a estimulação e ativação da medula óssea. A produção de células eritropoiéticas pode estar associada à produção de células osteogênicas, pela correlação das suas stem cells, ou pela liberação de fatores que afetam a diferenciação e proliferação dos componentes celulares estromais da medula óssea.(9) Um exemplo é a perda óssea que ocorre a partir da menopausa onde embora geralmente seja atribuída sua causa às alterações hormonais da mulher, é possível que o sangramento menstrual repetitivo mantenha a atividade osteoblástica da medula óssea contribuindo na manutenção da massa esquelética.(10,14) Ilizarov et al(9) concluiu que a perda sanguínea de 1% do peso corpóreo dos coelhos acelerava o processo de reparação óssea da osteotomia fibular.
O objetivo deste estudo foi avaliar a influência da resposta osteogênica sistêmica, causada pelo estímulo da medula óssea à distância, na consolidação de falha óssea.
MÉTODO
O experimento foi realizado no Setor de Cirurgia Experimental do Hospital do Servidor Público Estadual “Francisco Morato de Oliveira” de São Paulo, seguindo as normas do Colégio Brasileiro de Experimentação Animal (COBEA), filiado ao International Council for Laboratory Animal Science (ICLAS). Foram utilizados 36 coelhos adultos jovens, da raça nova zelândia branca, machos, com média de peso de 2,9kg (2,5 a 3,3kg). O protocolo anestésico consistiu de injeção intramuscular de solução composta de: cetamina (40mg/kg) e de xilazina (5mg/kg).(15) No momento da anestesia foram administradas 40.000 UI/kg intra-muscular de penicilina benzatina. Os coelhos não apresentaram sinais clínicos de desconforto ou dor durante o procedimento cirúrgico.
Os animais foram posicionados na mesa cirúrgica em decúbito lateral esquerdo, e foi realizada a tricotomia parcial do antebraço direito, anti-sepsia e assepsia de todo o membro. Realizou-se o esvaziamento venoso do membro com faixa elástica e garroteamento na raiz do braço (figura 1). Colocaram-se panos estéreis e praticou-se incisão reta de 2,5cm de extensão na face dorso-radial do antebraço direito, a partir de 1,5cm de distância proximal à articulação rádio-cárpica. Realizou-se dissecação entre os músculos abdutor longo do polegar e extensor radial do carpo até a exposição óssea do rádio. Com caneta de marcação cirúrgica criou-se duas marcações no rádio para delimitação do local correto para ostectomia (figura 2). Com utilização de mini-serra de aço de 0,5mm de espessura, procedeu-se à ostectomia retirando-se cilindro de 4mm deste osso, à distância de 2,5cm proximalmente à articulação rádio-cárpica, protegendo-se as partes moles e a ulna, e irrigando-se o local com 5ml de soro fisiológico (figura 3). Os músculos e o tecido celular subcutâneo foram aproximados com fio de sutura absorvível de ácido poliglicólico (Vicryl 3.0®), para minimizar sangramento pós-operatório e evitar interposição muscular na falha óssea criada. Suturou-se a pele com fio inabsorvível de náilon monofilamentar (Mononylon 4.0®). A estabilização do rádio não foi necessária, devida sua forte ligação à ulna pela membrana interóssea.
Os coelhos foram distribuídos aleatoriamente em três grupos (A, B e C), com doze animais cada. Nos animais do grupo A foi realizado estímulo da medula óssea pela abrasão da medula óssea do fêmur esquerdo pela aspiração de 3ml do conteúdo do canal medular, utilizando-se seringa de 20ml e agulha de punção para biópsia. A agulha foi posicionada dentro do canal medular femoral esquerdo através do trocânter maior até o fêmur distal, e a aspiração foi feita à medida que se retirava a agulha (figura 4). O material coletado do canal medular femoral foi desprezado.
No grupo B foi realizado estímulo da medula óssea pela introdução de fio de Kirschner com 1,5mm de espessura colocado no interior do canal medular femoral esquerdo. O fio foi inserido percutaneamente pelo trocânter maior, em direção à diáfise, onde ficou sepultado (figura 5). Confirmou-se o local de sepultamento do fio com radiografias de frente e perfil.
No grupo C, utilizado como grupo controle, não foi realizado estímulo à distância da medula óssea.
No pós-operatório imediato, aproveitando-se o mesmo ato anestésico, foram realizadas radiografias em posição de frente e perfil do antebraço direito (grupos A, B e C) (figura 6) e fêmur esquerdo em posição de frente e perfil (grupo B) (figura 7). As radiografias do antebraço foram repetidas, a cada sete dias até o 21o dia com aparelho de 36kv, 0,025mas e 100mA. O filme (Kodak®), modelo T-MAT G/RA de 18x24cm foi posicionado a 30cm de distância da ampola do aparelho de raios X.
Foram excluídos do estudo os animais que tiveram fratura concomitante da ulna (um coelho do grupo A), ou ostectomia incompleta do rádio (um coelho do grupo B).
No pós-operatório, os animais foram alojados em gaiolas individuais, onde receberam ração comercial e água ad libitum.
Todos os coelhos foram sacrificados no final da 4ª semana de pós-operatório, com pentobarbital sódico, na dose letal de 200mg/kg.(16) Em seguida o antebraço de cada animal foi radiografado nas posições de frente e de perfil (figura 8). Procedeu-se à dissecação do antebraço dos animais e a ressecção do rádio em conjunto com a ulna (figura 9). Após armazenamento em recipientes com formol a 10% tamponado adequadamente identificados, a região da ostectomia foi submetida à análise histomorfométrica.
Estudo histomorfométrico
Realizou-se a descalcificação das peças em ácido nítrico a 7% e incluídas em parafina. Foram realizados cortes histológicos de 3m de espessura em sentido coronal em micrótomo rotatório nos blocos de parafina contendo as amostras de calo ósseo, e que foram corados pela técnica de tricrômio de Masson para análise histomorfométrica. A qualificação dos diversos tipos de tecidos do calo ósseo foi realizada em sistema analisador de imagem (Kontron Electronic 300®).
Em cada animal foram somadas as áreas de tecido cartilagíneo, ósseo e fibroso, obtendo-se a área total do calo ósseo. A fração de área de cada tipo de tecido foi obtida pela relação entre a fração de área do tecido em questão dividida pela área do calo ósseo (figura 10).
Estudo radiográfico
As radiografias semanais foram analisadas pelo sistema do escore radiográfico de Lane e Sandhu(17) para avaliação da evolução da consolidação óssea no local da ostectomia por médico ortopedista sem acesso aos dados do estudo.
Análise Estatística
Foram utilizadas como medidas resumos a média, a mediana e o desvio-padrão, mínimo e máximo para apontar a variabilidade.(18)
No estudo histomorfométrico utilizou-se a análise de variância (ANOVA).(19) Na aplicação deste teste, a homogeneidade entre os grupos foi verificada pelo teste de Levene. Na presença de diferença significante entre os grupos, foram realizadas comparações múltiplas (comparações entre grupos dois a dois) pelo teste de Bonferroni para identificação dos grupos com diferenças entre si.
Para as notas do escore radigráfico de Lane e Sandhu(17) utilizou-se o teste não paramétrico de Medidas Repetidas para Dados Ordinais.(14,15) Por meio desta técnica foram avaliados os efeitos de grupo (comparação entre os três grupos), efeitos de momento (comparação entre as semanas) e efeitos de interação (comportamentos diferenciados em função de outra variável).
Para todos os testes, o nível de rejeição da hipótese de nulidade foi 0,05 (nível de significância de 95%) de acordo com os padrões para os estudos biológicos.
RESULTADOS
A porcentagem de células de fibrose, cartilagem e osso encontrada no estudo histomorfométrico do calo ósseo nos animais dos grupos A, B e C está relacionada nas tabelas 2, 3 e 4.
No estudo radiográfico observou-se diferença entre as semanas, independente dos grupos estudados, não se realizando comparação entre os grupos para cada semana, nem comparação entre as semanas para cada grupo, pois não houve efeito de interação (p=0,098). Nesse teste não foi constatada diferença entre os grupos, independente da semana (p=0,359).
DISCUSSÃO
O estudo da consolidação óssea e dos fatores de crescimento que a influenciam são crescentes na intenção de acelerar a recuperação dos pacientes com fraturas. Autores vêm realizando experimentos na tentativa de isolar substâncias produzidas nos organismos e que estariam relacionadas com a formação óssea.(9,11-13)
No coelho, o rádio e a ulna estão unidos firmemente por ligamentos na extremidade distal, e por forte membrana interóssea na região diafisária. O antebraço é pronado e não realiza o movimento de prono-supinação. Os músculos dorsais do antebraço (extensor dos dedos, extensor radial do carpo e abdutor longo do polegar) estão situados no mesmo plano.
Neste experimento foram utilizados três grupos animais: grupo A, submetido à ostectomia e ao estímulo da medula óssea à distância por abrasão, para avaliar a resposta osteogênica sistêmica após processo de regeneração medular intenso; grupo B, submetido à ostectomia e ao estímulo da medula óssea à distância pela colocação de um fio de Kirschner intramedular, para avaliar a resposta osteogênica sistêmica após processo de regeneração medular menor e grupo C, grupo controle, utilizado para comparação. Nos três grupos realizamos o esvaziamento sanguíneo e garroteameto do membro operado com faixa elástica para reduzir sangramento.
O estudo histomorfométrico foi utilizado como método de avaliação qualitativo e quantitativo do calo ósseo formado no local da ostectomia, pois essa técnica consegue identificar os tipos de células a serem estudadas (fibrose, cartilagem e osso). O tamanho de cada calo ósseo foi variável entre os animais e obteve-se a fração da área ocupada por cada tipo de tecido.
O estudo radiográfico foi utilizado para acompanhamento semanal da evolução da formação do calo ósseo e para comparação entre os grupos.
O processo de regeneração da medula óssea pode causar a liberação de fatores osteogênicos na circulação(4-8), porém julgamos não ser suficiente para influenciar na consolidação de falha óssea à distância. O estímulo indireto por sangramento isolado, independente de qualquer trauma esquelético ou da lesão da medula óssea, também pode estar associado com acentuada osteogênese. Mesmo pequena perda sanguínea pode induzir moderada estimulação da eritropoiese e conseqüente ativação da medula óssea.(9,10) Pode-se especular que a hematopoiese compensatória ocorre em resposta ao sangramento e, em certas condições, é mediada por aumentada osteogênese e possíveis atividades das células estromais da medula óssea. Lippiello et al(9) afirmaram que a perda sanguínea está associada com a liberação de fator circulatório, osteopoietina de acordo com esse autor, que acionaria a diferenciação e proliferação dos componentes celulares estromais da medula óssea. Lucas et al(10), sustentaram que a perda sanguínea apresenta magnitude idêntica ao trauma ósseo medular, no que se refere ao ganho de formação óssea (número de osteoblastos, taxa mineral de aposição, fosfatase alcalina, peptídeo de crescimento e osteocalcina). Que seja do nosso conhecimento, não foram realizados experimentos semelhantes que utilizaram garroteamento do membro operado para minimizar a perda sanguínea. Utilizamos o esvaziamento sanguíneo e garroteamento na raiz do membro operado para homogenizar os grupos e avaliar isoladamente o estímulo da medula óssea à distância, sem a influência da perda sanguínea variável.
Os resultados do presente estudo encontraram maior número de células ósseas no final da consolidação dos animais do grupo C (controle) quando comparado aos demais. Quando foi realizada ostectomia associada com redução do sangramento no ato operatório, o estímulo da medula óssea à distância não gerou resposta osteogênica suficiente para estimular a consolidação da falha óssea, e ainda atrasou a maturação celular do calo ósseo revelada pelo maior número de células cartilagíneas nos animais do grupo A.
No experimento realizado por Gazit et al(6), a lesão da medula óssea não apresentou aumento da produção de fatores osteogênicos quando sua regeneração foi inibida pela colocação de silicone. Este aumento só foi verificado nos casos em que ocorria intensa regeneração medular. Verificamos que a colocação do fio de Kirschner à distância do foco da fratura (grupo B), também não gerou resposta osteogênica sistêmica a ponto de interferir no processo de consolidação, pois provavelmente a colocação do fio não solicitou regeneração medular intensa, diferindo dos resultados encontrados na literatura(4,7). É possível que a redução do sangramento no ato operatório também possa ter influenciado estes resultados.
A diferença dos resultados do presente experimento comparados com os da literatura pode ser explicada pelos seguintes argumentos: a) a existência de poucos estudos com este tipo de experimento; b) número reduzido de experimentos utilizando coelho como animal de experimentação; c) a utilização de diferentes critérios metodológicos em cada estudo; d) a redução do sangramento no ato operatório pela utilização de garrote.
Estudos adicionais necessitam ser realizados para confirmar os achados obtidos no presente experimento, e assim melhor entendimento dos mecanismos sistêmicos que possam influenciar na consolidação de fraturas.
CONCLUSÃO
Nas condições desse experimento e em função dos resultados obtidos concluiu-se que o estímulo da medula óssea à distância, associado à redução do sangramento intra-operatório, influenciou desfavoravelmente a consolidação de falha óssea em coelhos.
AGRADECIMENTOS
Agradecemos a ajuda e empenho do Setor de Cirurgia Experimental do IAMSPE-SP e do Dr.Antônio Tenor que contribuíram na realização do experimento.
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